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有機(jī)磷殺蟲劑抑制昆蟲乙酰膽堿酯酶活性測定 目的要求 通過本試驗了解有機(jī)磷殺蟲劑對昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用。由于乙酰膽堿累積,神經(jīng)受過度刺激,膽堿能系統(tǒng)破壞(或受阻),而引起昆蟲中毒以致死亡。 本試驗采用酶化學(xué)比色法測定受藥處理后中毒昆蟲酶被抑制程度。此原理也可應(yīng)用于對農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷殺蟲劑殘留分析和有機(jī)磷中毒病人血液中膽堿酯酶活性的 測定。 原理 當(dāng)有機(jī)磷殺蟲劑與乙酰膽堿酯酶相互作用時,乙酰膽堿酯酶被抑制,不能水解乙酰膽堿,昆蟲體內(nèi)乙酰膽堿累積,從而致使中毒。 本法以有機(jī)磷處理昆蟲后,取昆蟲頭部研磨成勻漿液作酶源,與定量的乙酰膽堿再一定條件下,經(jīng)該酶水解后剩余的乙酰膽堿與堿性羥胺作用生成異羥虧酸,再與三氯化鐵作用生成羥虧酸鐵絡(luò)化合物(紅棕色)。用分光光度計測定其光密度值。如酶被抑制高時,剩余的乙酰膽堿多,光密度值大,反之,則光密度小。 實驗材料 試劑: ①磷酸鹽緩沖液 稱取純結(jié)晶磷酸氫二鈉16.72g及磷酸二氫鉀2.72g,以重蒸餾水溶解并注入倒1000ml容量瓶中,PH7.2。 ②0.004M溴化乙酰膽堿溶液 準(zhǔn)確稱取溴化乙酰膽堿0.1809g,以磷酸鹽緩沖液溶解并注入到200ml容量瓶中,加磷酸鹽緩沖液至刻度。 ③2M鹽酸羥胺溶液 稱取鹽酸羥胺13.9g溶于100ml重蒸餾水中。 上述三種試劑配制后均存入冰箱中備用 ④3.5M氫氧化鈉溶液 稱取氫氧化鈉14g溶于100ml蒸餾水中。 ⑤1:2鹽酸溶液 用化學(xué)純鹽酸1份加蒸餾水2份 ⑥0.37M三氯化鐵溶液 稱化學(xué)純六水三氯化鐵100g溶于0.1M HCl溶液中,最后定容至1000ml 實驗用具:玻璃勻漿器、攪拌機(jī)、小剪刀、水浴控溫?fù)u床(或恒溫水浴箱)、玻璃絲、10ml試管、721分光光度計、0.5、1.0、2.0ml吸液管等。 酶的制備:以5%敵敵畏丙酮液在每頭昆蟲的 胸背板處點滴2微升(供試?yán)ハx可用粘蟲、棉鈴蟲等),處理后約經(jīng)30-0分鐘,當(dāng)昆蟲中毒并接近死亡時,立即用小剪刀剪下20頭昆蟲頭部盛于玻璃勻漿器內(nèi)(預(yù)先吸入約3ml冰冷的磷酸緩沖液),在低溫條件下進(jìn)行勻漿,以少量玻璃絲置于小型漏斗上把蟲漿過濾,濾液用磷酸鹽緩沖液定容至5ml,暫儲存于冷凍室內(nèi)備用。 另取20頭正常(無藥處理)昆蟲頭部,勻漿處理與上述藥劑處理組相同。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取試管12支分為6組,用吸管分別注入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2ml的試劑②于各組已作標(biāo)記試管中,并分別加入試劑①至試管中,使各管的溶液總量為1.5ml。然后將1-5組試管分別加入2ml試劑③加入④混合液(按1:1比例臨時混合),用力搖動1分鐘,加入1ml試劑⑤搖勻,加入1ml試劑⑥,搖勻后呈現(xiàn)深淺不同顏色。第六組試管在加入試劑①至總量達(dá)1.5ml后,先加入試劑⑤1ml,搖勻后加入2ml試劑③加④混合液(按1:1比例臨時混合),搖勻后加1ml試劑⑥,搖勻即成空白管。 樣本分析 取潔凈的試管9支,編號為1(1)、1(2),(指正常蟲管);2(1)、2(2),(指正常蟲對照管);3(1) 、3(2),(藥劑處理管);4(1)、4(2),(藥劑處理對照管);5(空白管)。于各試管中加入1ml試劑②,1與3管各加0.5ml正常蟲和藥劑處理后的 蟲漿,5號管加入0.5ml磷酸鹽緩沖液,搖勻后置于預(yù)先調(diào)好為37度的恒溫水浴搖床里40分鐘。除空白管外,其它各管應(yīng)立即加入2ml試劑③加④混合液(按1:1比例臨時混合),用力搖動1分鐘以上,2對4對照管分別加入正常蟲和藥劑處理蟲的 蟲漿液各0.5ml。搖勻后加試劑⑤1ml,搖勻后再加試劑⑥1ml,搖勻后用濾紙過濾,空白管的制作同標(biāo)準(zhǔn)曲線中的空白管制作相同。 測定和結(jié)果整理 把標(biāo)準(zhǔn)或樣本按制作步驟完成后,將濾液分別移至各比色杯中,用分光光度計在波長540微米下進(jìn)行測定。以空白管調(diào)節(jié)光密度為“0”,分別測定標(biāo)準(zhǔn)或樣本管并讀出它們的光密度數(shù)值。 以不同濃度的乙酰膽堿量(微克分子濃度)數(shù)值做橫坐標(biāo),各管測得的光密度做縱坐標(biāo)即可繪制成一標(biāo)準(zhǔn)曲線。把測定樣本的 光密度值可從標(biāo)準(zhǔn)曲線坐標(biāo)上求出樣本的乙酰膽堿量。從而代入公式,求乙酰膽堿酶被抑制百分率(%)。 受藥后5齡粘蟲(頭部)乙酰膽堿酯酶被抑制率(%): 酶被抑制率(%)=【正常蟲酶活性(水解ACh量)-受藥蟲酶活性(水解Ach量)】/正常蟲酶活性(水解ACh量)×100 |
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