有機磷殺蟲劑抑制昆蟲乙酰膽堿酯酶活性測定

有機磷殺蟲劑抑制昆蟲乙酰膽堿酯酶活性測定
目的要求
    通過本試驗了解有機磷殺蟲劑對昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用。由于乙酰膽堿累積，神經(jīng)受過度刺激，膽堿能系統(tǒng)破壞（或受阻），而引起昆蟲中毒以致死亡。
    本試驗采用酶化學比色法測定受藥處理后中毒昆蟲酶被抑制程度。此原理也可應用于對農產品中有機磷殺蟲劑殘留分析和有機磷中毒病人血液中膽堿酯酶活性的 測定。
原理
    當有機磷殺蟲劑與乙酰膽堿酯酶相互作用時，乙酰膽堿酯酶被抑制，不能水解乙酰膽堿，昆蟲體內乙酰膽堿累積，從而致使中毒。
    本法以有機磷處理昆蟲后，取昆蟲頭部研磨成勻漿液作酶源，與定量的乙酰膽堿再一定條件下，經(jīng)該酶水解后剩余的乙酰膽堿與堿性羥胺作用生成異羥虧酸，再與三氯化鐵作用生成羥虧酸鐵絡化合物（紅棕色）。用分光光度計測定其光密度值。如酶被抑制高時，剩余的乙酰膽堿多，光密度值大，反之，則光密度小。
實驗材料
    試劑：
    ①磷酸鹽緩沖液  稱取純結晶磷酸氫二鈉16.72g及磷酸二氫鉀2.72g，以重蒸餾水溶解并注入倒1000ml容量瓶中，PH7.2。
    ②0.004M溴化乙酰膽堿溶液 準確稱取溴化乙酰膽堿0.1809g，以磷酸鹽緩沖液溶解并注入到200ml容量瓶中，加磷酸鹽緩沖液至刻度。
    ③2M鹽酸羥胺溶液 稱取鹽酸羥胺13.9g溶于100ml重蒸餾水中。
    上述三種試劑配制后均存入冰箱中備用
    ④3.5M氫氧化鈉溶液  稱取氫氧化鈉14g溶于100ml蒸餾水中。
    ⑤1：2鹽酸溶液  用化學純鹽酸1份加蒸餾水2份
    ⑥0.37M三氯化鐵溶液  稱化學純六水三氯化鐵100g溶于0.1M HCl溶液中，最后定容至1000ml
    實驗用具：玻璃勻漿器、攪拌機、小剪刀、水浴控溫搖床（或恒溫水浴箱）、玻璃絲、10ml試管、721分光光度計、0.5、1.0、2.0ml吸液管等。
    酶的制備：以5％敵敵畏丙酮液在每頭昆蟲的 胸背板處點滴2微升（供試昆蟲可用粘蟲、棉鈴蟲等），處理后約經(jīng)30-0分鐘，當昆蟲中毒并接近死亡時，立即用小剪刀剪下20頭昆蟲頭部盛于玻璃勻漿器內（預先吸入約3ml冰冷的磷酸緩沖液），在低溫條件下進行勻漿，以少量玻璃絲置于小型漏斗上把蟲漿過濾，濾液用磷酸鹽緩沖液定容至5ml，暫儲存于冷凍室內備用。
    另取20頭正常（無藥處理）昆蟲頭部，勻漿處理與上述藥劑處理組相同。
標準曲線的制作
    取試管12支分為6組，用吸管分別注入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2ml的試劑②于各組已作標記試管中，并分別加入試劑①至試管中，使各管的溶液總量為1.5ml。然后將1-5組試管分別加入2ml試劑③加入④混合液（按1：1比例臨時混合），用力搖動1分鐘，加入1ml試劑⑤搖勻，加入1ml試劑⑥，搖勻后呈現(xiàn)深淺不同顏色。第六組試管在加入試劑①至總量達1.5ml后，先加入試劑⑤1ml，搖勻后加入2ml試劑③加④混合液（按1：1比例臨時混合），搖勻后加1ml試劑⑥，搖勻即成空白管。
樣本分析
   取潔凈的試管9支，編號為1（1）、1（2），（指正常蟲管）；2（1）、2（2），（指正常蟲對照管）;3(1) 、3(2),（藥劑處理管）；4（1）、4（2），（藥劑處理對照管）；5（空白管）。于各試管中加入1ml試劑②，1與3管各加0.5ml正常蟲和藥劑處理后的 蟲漿，5號管加入0.5ml磷酸鹽緩沖液，搖勻后置于預先調好為37度的恒溫水浴搖床里40分鐘。除空白管外，其它各管應立即加入2ml試劑③加④混合液（按1：1比例臨時混合），用力搖動1分鐘以上，2對4對照管分別加入正常蟲和藥劑處理蟲的 蟲漿液各0.5ml。搖勻后加試劑⑤1ml，搖勻后再加試劑⑥1ml，搖勻后用濾紙過濾，空白管的制作同標準曲線中的空白管制作相同。

測定和結果整理
     把標準或樣本按制作步驟完成后，將濾液分別移至各比色杯中，用分光光度計在波長540微米下進行測定。以空白管調節(jié)光密度為“0”，分別測定標準或樣本管并讀出它們的光密度數(shù)值。
     以不同濃度的乙酰膽堿量（微克分子濃度）數(shù)值做橫坐標，各管測得的光密度做縱坐標即可繪制成一標準曲線。把測定樣本的 光密度值可從標準曲線坐標上求出樣本的乙酰膽堿量。從而代入公式，求乙酰膽堿酶被抑制百分率（％）。
     受藥后5齡粘蟲（頭部）乙酰膽堿酯酶被抑制率（％）：
  酶被抑制率（％）＝【正常蟲酶活性（水解ACh量）-受藥蟲酶活性（水解Ach量）】/正常蟲酶活性（水解ACh量）×100

哎呀，太專業(yè)了，不懂，還是要頂一下

這幾個貼還真是有夠專業(yè)的