雜交中稲生育后期劍葉早衰及調(diào)控

雜交中稲生育后期劍葉早衰及調(diào)控

熊達有  原江西第三制藥廠

摘要：雜交中稲生育后期劍葉早衰是受高溫強光逆境脅迫加速了葉片的光氧化進程。葉片過早衰老削弱了葉片的光合量，減少了灌漿物質(zhì)的來源，影響水稻產(chǎn)量和大米的外觀質(zhì)量。本研究采用化學(xué)誘導(dǎo)法喚醒植物本身具有的防御自然災(zāi)害的基因，通過分子遺傳學(xué)手段延緩植物葉片衰老。

（一）      前言

衰老是指生理成熟后，導(dǎo)致植株. 器官. 組織或細胞走向死亡的過程，這是一個受遺傳調(diào)控的程序化過程。雜交中稲生育后期受高溫強光逆境脅迫而產(chǎn)生的躍變型的衰老過程，它不是自然衰老的根本原因，只是一種器官水平上的程序化死亡過程，因此劍葉早衰是可防控。

著名植物生理學(xué)家婁成后院士在一次學(xué)術(shù)報告指出：植物與環(huán)境之間的相互作用，遺傳基因在功能上表達，放大與變異，修飾；基因的破損，關(guān)閉與消失，以及多基因間的協(xié)調(diào)效應(yīng)，順序運行，大多數(shù)是在環(huán)境變化的啟動下或干擾下才實現(xiàn)的，善于運用逆境與順境的機遇，把激素的化學(xué)物質(zhì)，施到作物上是調(diào)節(jié)作物生長發(fā)育，改善作物的抗逆性是最有效的手段（1）。一種化學(xué)物質(zhì)只能誘導(dǎo)一個基因表達，兩種或兩種以上的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)與一些生理活性物質(zhì)混合使用，有可能多個有益的基因表達，從而呈現(xiàn)增效，加合或互補的應(yīng)用效果（2）。隨著全球氣候變暖，水稻的高溫危害正日益引起世界的廣泛關(guān)注，這給水稻生產(chǎn)和糧食安全造成很大的沖擊。國內(nèi)外專家學(xué)者開展了廣泛的理論研究，但涉及如何采用化學(xué)物質(zhì)調(diào)控基因表達發(fā)表的成果不多。水稻在漫長的進化過程中已具備防御自然災(zāi)害的基因，只不過是水稻的這種基因經(jīng)過長時間的選育和過度的保護性栽培使得這種功能逐漸處于休眠；鈍化；甚至喪失。本研究是利用化學(xué)誘導(dǎo)法去喚醒處于休眠狀態(tài)的基因重新表達，通過分子遺傳學(xué)手段延緩葉片的衰老（3）。

根據(jù)化學(xué)誘導(dǎo)調(diào)控理論指導(dǎo)，筆者研發(fā)了“6BA+GA3+PCPA”復(fù)合制劑，通過多年的田間試驗，結(jié)果表明該配方所產(chǎn)生的群體效應(yīng)及基因間的協(xié)調(diào)效應(yīng)：源葉壽命延長；光合作用效應(yīng)增強；籽粒庫容擴大；光合產(chǎn)物裝卸速度加快。

本技術(shù)符合發(fā)明專利的新穎性，創(chuàng)造性，實用性，國家知識產(chǎn)權(quán)已受理（201410405890）

（二）葉片早衰產(chǎn)生的原因

以光能激活而產(chǎn)生的光化學(xué)反應(yīng)，除了光合作用外，還有光氧化反應(yīng)，光氧化反應(yīng)在日常生活中司空見慣，有些化學(xué)藥品（Vc、VE、SA等）見光變色說明這些化學(xué)藥品已發(fā)生光氧化反應(yīng)，為避免發(fā)生光氧化反應(yīng)，常采用棕色瓶包裝，液體藥劑中常加入少量的抗氧化劑�？寡趸瘎┚褪沁�原劑，通過還原劑首先被氧化而保護藥劑本身的延緩氧化的作用，確保藥劑在安全期內(nèi)有效成分符合質(zhì)量標準。C3植物（小麥，水稻等）在富氧環(huán)境里光氧化現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生，水稻葉片的光合速度在一定的溫度范圍內(nèi)隨光照強度的增加而提高。上世紀八十年代有人發(fā)現(xiàn)植物葉片在強光照射下，其光合速度反而下降的現(xiàn)象，人們稱這現(xiàn)象叫光抑制（或叫光保護）。這可能是植物在逆境環(huán)境中，誘抗素（ABA）在細胞間傳遞信息與保衛(wèi)細胞的鉀離子相應(yīng)位點接合，通過一系信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最終完成部分氣孔關(guān)閉，進行“午休”。氣孔是植物代謝的門戶，氣孔關(guān)閉直接影響CO2的同化及水汽蒸騰的速度。我們都知道光合作用是由光反應(yīng)與碳反應(yīng)所組成，它們之間相互依存，相互制約。CO2是碳反應(yīng)的原料，隨著CO2吸收的減少，碳反應(yīng)速度減慢，導(dǎo)致光能轉(zhuǎn)換的障礙；熱量累積及過剩電子滯留在植物體內(nèi)。大家都知道，化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生必須要有一定的能量激發(fā)，滯留在體內(nèi)的熱量愈高被激活的氧分子愈多，處于激活狀態(tài)下的氧分子與過剩的電子結(jié)合而生成活性氧即自由基（O2），O2的氧化能力強，水稻葉片的光氧化傷害是由活性氧引發(fā)的（4）。有金屬離子存在下能加速光氧化的進程，原因是金屬離子能催化活性氧發(fā)生Haber—weis反應(yīng)生成活性更強的羥基自由基（.OH）它能氧化所有的細胞成分，直接引起膜脂的過氧化，葉綠素的“漂白”。

O2+e    02  

H2O2+O2    OH+OH+O2

H2O2+O2+2H    H2O2+O2

H2O2    H2O+O2

（三）細胞分裂素（CTK）延緩葉片衰老機理探討

早在1957年Richmond&Lang用離體蒼耳葉片浸泡在激動素的溶液里，發(fā)現(xiàn)該葉片在較長時間里仍保持綠色，人們對這一發(fā)現(xiàn)抱有很高的期望，經(jīng)過大量的研究，CTK延緩葉片衰老得到肯定，我國在文革期間（1975）上海農(nóng)科院和沈陽化工研究院合作開發(fā)6BA的田間試驗；20ppm6BA水溶液噴施生長勢不同的植株上，發(fā)現(xiàn)6BA能延緩葉片的衰老；葉綠素含量比對照增加10%-40%，灌漿速度加快，千粒重比對照高0.2克-2.0克，結(jié)實率提高2%-4%，增產(chǎn)3.1%-19.1%，其中長勢差的增幅較大。而不同品種CTK（激動素，玉米素.6BA）以6BA的效果最明顯（5）。關(guān)于CTK延緩葉片衰老的機理，眾說紛紜。

葉片衰老的特征是葉片黃化，葉綠素，蛋白質(zhì)，脂肪，核酸的降解。葉綠體是葉片蛋白的主要貯存器官（70%-80%）有人證實，從衰老葉片中輸出的氮，90%是來自葉綠體，蛋白質(zhì)的降解的起始階段可能是在完整的葉綠體內(nèi)進行。

有人認為6BA延緩葉片衰老的作用機理可能是延緩葉片蛋白質(zhì)的降解（6）。潘瑞熾教授（1993）認為：6BA能加強葉綠素的生物合成過程，同時可使小麥葉片光合磷酸化活性增強，進一步研究證實小麥葉片葉綠體中存在6BA專一結(jié)合的蛋白質(zhì)。ABA與6BA有拮抗效應(yīng)，可能是6BA改變了結(jié)合蛋白的某些性質(zhì)（7）。

Gross&Leshem(1978)報導(dǎo)，CTK能降解葉片衰老組織中脂氧合酶活性，而Leshem(1979)認為CTK可能作為自由基的淬火劑，因為CTK分子結(jié)構(gòu)中氨基鍵上的H可以脫去產(chǎn)生酰胺，從而降低了膜脂的過氧化作用，保持膜的完整性。比較一致看法是CTK可以改善葉片活性氧代謝，降低了活性氧對細胞組織的傷害，這一點已得到肯定。外用CTK延緩葉片衰老的確切機理尚不清楚，有可能是影響了內(nèi)源CTK水平，補償旗葉后期CTK的不足，同時又促進了根系合成和CTK的運輸能力，可能是延緩衰老的重要原因。

還有一些人認為葉片的衰老與葉片氣孔開啟度有關(guān)；日本的倉石晉用一個簡單的小實驗說明葉片氣孔的作用，他用凡士林將氣孔封閉，發(fā)現(xiàn)CTK不能延緩葉片的衰老，持上述觀點的當時還有美國的蒂曼。他們認為CTK能促進氣孔開放，從而促進了處理區(qū)的水汽蒸騰散熱的作用，消除體內(nèi)積累的熱量，阻止活性氧的產(chǎn)生。

自從Mccod（1969）和Fridorich(1975.1978)發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)存在超氧歧化酶（SOD）后關(guān)于生物體內(nèi)的自由基反應(yīng)以及由此引發(fā)的脂質(zhì)的過氧化問題，引起人們的關(guān)注。自由基衰老學(xué)說已成為最活躍的研究領(lǐng)域。SOD是植物氧化代謝最主要的抗氧化酶，SOD的功能就是清除生物體內(nèi)的自由基，其作用機理就是通過發(fā)生歧化反應(yīng)生成無毒的氧氣和毒性較低的過氧化氫，而過氧化氫再被CAT或POD分解成水和氧氣，最大限度限制氧自由基和過氧化氫發(fā)生反應(yīng)生成羥基自由基的能力。較多的人認為CTK對葉片延緩衰老的作用與對細胞的SOD的調(diào)控作用有關(guān)。段留生等研究結(jié)果表明（10）：6BA提高了衰老后期旗葉中SOD和POD的活性，降低了自由基的含量，改善了活性氧代謝，延緩了旗葉衰老，表現(xiàn)在葉綠素和膜脂的過氧化程度。對此有人提出異議這不是CTK延緩葉片衰老的原發(fā)作用，仍有待進一步完善。

筆者認為，細胞分裂素延緩葉片衰老的機理可能與CTK分子結(jié)構(gòu)中—NH2有一定關(guān)系，這種假設(shè)是根據(jù)分子結(jié)構(gòu)中游離—NH2與蛋白質(zhì)，氨基酸核酸有較大的親和力，從而形成一種保護層，抑制了蛋白質(zhì)降解。一般認為，PSⅡ的D1蛋白是活性氧傷害的主要靶器官，6BA分子結(jié)構(gòu)中—NH2與D1蛋白的結(jié)合，保護了活性氧對D1蛋白的傷害。維護高效率D1蛋白的周轉(zhuǎn)是保護光合機構(gòu)的關(guān)鍵，這種理論假設(shè)可以用以下事例證明：

(1) 多胺是分子結(jié)構(gòu)中有多個—NH2的化合物的總稱，黃維玉的研究結(jié)果指出：以腐胺，亞精胺，精胺溶液滲入小麥離體葉片，在黑暗條件下，對照葉綠素有所下降，而三胺處理的葉片有明顯的保綠效果：精胺（4胺）﹥亞精胺（3胺）﹥腐胺（2胺）增綠效果隨NH2數(shù)目增多而效果明顯增強，研究者認為多胺能緩葉片衰老與清除自由基的功能有關(guān)，多胺都具有刺激作物生長，抗衰老與調(diào)控核酸，蛋白質(zhì)的合成作用有關(guān)（8）。

(2)甲殼胺分子結(jié)構(gòu)中的游離—NH2對各種蛋白質(zhì)的親和力較強，可用來作酶，抗原；抗原體等生理活性物質(zhì)的固定化載體，使酶細胞保持高度的活力，進一步研究結(jié)果表明：甲殼胺分子結(jié)構(gòu)中—NH2略帶正電荷與略帶負電荷的脂肪，核酸蛋白質(zhì)能相聚結(jié)合，6BA分子結(jié)構(gòu)中的氨基與葉片內(nèi)蛋白質(zhì)形成一個保護層從而延緩了蛋白質(zhì)的降解。

(3)6BA分子結(jié)構(gòu)中—NH2同樣對各種蛋白質(zhì)，氨基酸具有較強的親和力，這一點從法國的Mother X光片自顯影的方法上很容易觀察到放射性處理過氨基酸向6BA處理的部位聚集。李玲（1989）“細胞分裂素結(jié)合蛋白的研究進展”一文指出：細胞內(nèi)存在一種結(jié)合蛋白，結(jié)合蛋白就是受體，6BA分子結(jié)構(gòu)中的游離—NH2與受體蛋白質(zhì)的特異結(jié)合，在細胞間的傳導(dǎo)，從而引起一系列的生理效應(yīng)。潘瑞熾教授用電子顯微鏡放射自顯影方法，發(fā)現(xiàn)6BA既可和質(zhì)膜，液泡膜及線粒體膜相結(jié)合，又可和細胞核特別是核仁相結(jié)合，說明6BA的受體呈現(xiàn)多位點結(jié)合現(xiàn)象（7）。后來人們又在擬南芥中發(fā)現(xiàn)AHK4才是CTK真正的受體蛋白，細胞分裂素同AHK4細胞外區(qū)域直接結(jié)合，并激活其在細胞內(nèi)的組氨酸酶活性從而將激素信號跨膜傳遞。

(4)細胞分裂素信號傳導(dǎo)途徑的研究是闡明細胞分裂素作用分子機理的關(guān)鍵。從分子水平闡明植物激素受體功能以及植物激素對植物基因的表達的調(diào)控機制.進而通過植物基因的手段.將農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以更高的水平迅猛發(fā)展（11）。

（四）自由基清除的新論點

隨著科學(xué)研究深入發(fā)展，清除自由基成功的事例越來越多，將這些成功事例串聯(lián)起來，綜合分析你會驚人發(fā)現(xiàn)：氧自由基的清除與廣義的氧化還原反應(yīng)原理是一致的。自由基即游離基，是生物代謝過程中產(chǎn)生的未配對電子原子，自由基活性強，在一般條件下不能穩(wěn)定單獨存在，有人比喻自由基是“單身漢”，容易自行結(jié)合或掠奪其他化合物的電子，細胞膜系統(tǒng)是自由基攻擊的靶器官，外源適當水平的抗氧化劑與生物體內(nèi)的O2進行電子傳遞的氧化還原反應(yīng)，一種物質(zhì)得到電子，另一種物質(zhì)失去電子，得失電子數(shù)目相等，O2是氧化劑得到電子變成無毒害的氧分子，原來的氧自由基的氧化能力頓時灰飛煙滅；上述的理論假設(shè)可以從下面科研成果得到驗證：

1 花卉在儲運過程中，切花葉片易變黃，標志看葉片內(nèi)蛋白質(zhì)，核酸，葉綠素的降解，在儲運前采用苯甲酸或培酸丙脂，一定濃度處理葉片，能阻止葉片變黃；苯甲酸或核酸丙酯都是食品加工中應(yīng)用的抗氧化劑，也是最早應(yīng)用在植物上作保鮮劑。其抗氧化作用機理就是清除自由基，延長切花的壽命。

   

2 VE（生育酚）廣泛存在綠色植物中，VE化學(xué)藥品在空氣中慢慢氧化，有亞鐵離子存在時氧化速度加快。2mmol濃度VE處理離體小麥葉片，可減緩葉綠素和蛋白質(zhì)的降解，SOD活性沒有下降。MDA累積減少（9）。

   

3 VC（抗壞血酸）廣泛存在于水果，蔬菜里的一種維生素，在植物體內(nèi)參與電子傳遞系統(tǒng)中的氧化還原作用，促進植物新陳代謝。VC有自由基清除的功能，是較強的還原劑，見空氣易氧化變色。

   

4 SA（水楊酸）是植物體內(nèi)含有的天然苯酚類；植物生長調(diào)節(jié)劑，也是一種具有生理活性化合物，見光變色。SA能提高作物的抗逆能力，增加葉綠素含量，減少葉片的蒸騰，提高SOD活性，汪小峰(1998)報導(dǎo),用SA處理小麥葉片，能提高葉片的葉綠素和蛋白質(zhì)含量，抑制活性氧的增加。保護膜的完整性，在小麥灌漿期間，噴1—2次乙酰水楊酸，可延長葉片的光合作用，提高結(jié)實率10%—12%。其他苯酚類化合物，如對苯二砏，鄰苯二砏，間苯二砏都具有抗氧化功能。

   

5亞硫酸（HSO3）是還原劑，在氧化還原反應(yīng)中能提供電子，早期的田間試驗中用0.05%濃度噴施水稻葉片，能促使葉片由黃轉(zhuǎn)綠色，增加光合作用，提高水稻產(chǎn)量；用2m moL濃度HSO3處理小麥葉片，促進葉片內(nèi)SOD酶的含量2.5%；在大豆品種試驗結(jié)果（中國科學(xué)院植物所提供）：大豆葉片的光合強度提高15.6%，抑制光呼吸強度32.2%，對葉綠素希爾效應(yīng)活性提高28.9%，增產(chǎn)效果可達15%左右。其他不飽和如亞硝酸HNO2草酸都具有清除O2的功能，其作用機理就是提供電子使氧自由基生成O2從而清除自由基對葉綠素蛋白質(zhì)的過氧化作用，保持膜的完整性。

(五) 結(jié)果與討論

延緩葉片衰老有多種途徑：一是通過調(diào)控葉片氣孔開放度，加強蒸騰消除體內(nèi)的熱量累積；減少活性氧產(chǎn)生的活化能；

二是活性氧產(chǎn)生后也可通過抗氧化劑的使用，以廣義的氧化還原反應(yīng)的電子傳遞而消除O2；

三是采用保護活性氧傷害的靶器官PSII的D1蛋白，維持高效率D1蛋白的周轉(zhuǎn)運行，從而保護光合機構(gòu)的正常運轉(zhuǎn)，都能達到延緩葉片衰老的基本要求。而如何調(diào)控環(huán)境因素來最大限度增加光合強度，提高光合效率是本技術(shù)綜合解決方案。蘇寶林“水稻栽培技術(shù)”一書指出：水稻高產(chǎn)技術(shù)的實質(zhì)就是合理調(diào)整葉片（包括調(diào)整葉片積大小，葉片的長相）提高葉片的光合物質(zhì)的生產(chǎn)能力。

（1）（6BA+GA3+PCPA）復(fù)合制劑使用方法及應(yīng)用效果

在水稻抽穗10%左右，用本藥劑100ml，稀釋400倍，每畝噴施40升；葉片噴施處理，應(yīng)用效果如下：

(A) 提高水稻的抗逆性能，延緩劍葉早衰，光合功能期延長。

GA3的抗逆性能雖然沒有6BA強，但6BA+GA3能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，抗逆性能進一步加強。水稻生長旺盛時，內(nèi)源GA3水平高，在進入成熟，走向衰老之前，內(nèi)源GA3水平較低，用GA3處理能明顯抑制乙烯的合成。生物體內(nèi)的衰老和抗衰的機制是同時起作用，這是生物生存的基本機理，ABA和乙烯是促進衰老，而6BA+GA3是起到抗衰老的作用，所以在衰老過程中的激素間的調(diào)控是包含著激素間的平衡作用，外源6BA+GA3改善了激素間的平衡作用，使水稻在早衰過程中逆轉(zhuǎn)。

（B）GA3的功能促進葉片面積擴大5—6平方厘米；6BA最明顯的促進葉綠體的層狀結(jié)構(gòu)的發(fā)育，使質(zhì)體數(shù)目明顯增多，葉片厚度增加，葉綠素含量增多，同時葉片的脈絡(luò)變得粗壯使葉片長勢挺直向上，葉片的向光度增加，下部葉片的通風(fēng)透光得到改善，有利葉片在流動的空氣中捕獲微量的二氧化碳，變成光合作用的原料，提高光合效率。有人作過計算，水稻的產(chǎn)量90%來自光合作用的產(chǎn)物，合理的水肥管理也只是改善水稻的光合機構(gòu)，因而水稻的光能利用來增加產(chǎn)量是一切栽培育種的目標。

（C）6BA和PCPA的生理功能都具有刺激細胞分裂和組織分化，刺激子房膨大，促進坐果和果實膨大。6BA+PCPA產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)從宏觀上看就是葉片的脈絡(luò)變得粗壯，莖桿結(jié)實，籽粒的庫容擴大，以試驗品種汕優(yōu)63為例，常規(guī)千粒重27—28克，而試驗結(jié)果可達31.7克，凈增3.17克；從這數(shù)字說明光合作用功能期延長，光合產(chǎn)物供應(yīng)充實與葉片早衰產(chǎn)生的空秕粒形成鮮明對照。

（D）低節(jié)位分蘗在GA3的作用下拔長起來，主莖穗與分蘗穗高度相差不大，齊穗時間縮短兩天；控制分蘗和促進分蘗都是一項增產(chǎn)措施，關(guān)鍵是水稻生育后期的生長勢決定，而當今雜交水稻的弱勢之一是“前期有余，后期不足”通過使用本產(chǎn)品能改善生育后期劍葉早衰的弱勢；促使低節(jié)位的分蘗形

成有效穗，也是本產(chǎn)品增產(chǎn)的一個亮點。

（E）灌漿速度加快有利光合產(chǎn)物向籽粒方向轉(zhuǎn)運。

婁成后院士在（植物生長調(diào)節(jié)劑發(fā)展前途的管見）一文指出：“植物生長發(fā)育的”“化學(xué)調(diào)控”是繼“化學(xué)施肥”之后對提交大田生產(chǎn)的又一重大貢獻”

參考文獻

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②陳虎保（2001）“中國植物生理學(xué)會.  植物生長物質(zhì)委員會刊”

③張軍（1999）中國植物生理學(xué)會植物生長物質(zhì)應(yīng)用研討會論文集“基因表達的化學(xué)調(diào)控”

④季本華等（J）植物生理學(xué)1994 20（1）8-16

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⑨宋純鵬等“植物學(xué)通報”1993 10（3）48-50

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